分子生化

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服务介绍

蛋白表达纯化       

       重组蛋白表达纯化技术服务已被广泛用于生命科学和医学等研究领域。近十年来,随着药物蛋白的快速发展与应用,高纯度活性蛋白的需求量也与日俱增。沃登医学凭借专业的蛋白表达纯化技术,可提供不同级别的活性蛋白定制服务。我们专注高质量的蛋白生产,可以有效地为您节约原料成本和时间成本。

服务内容

1、蛋白的诱导表达。

    1)将表达菌株在3mL LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1mM。37度诱导过夜(一般3 h以上即有大量表达)。

    2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

    3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1mL左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

    4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180 rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

2、 包涵体检测。

3、如有上清表达,则扩大摇菌。

    1)取保种的表达菌株先摇10 mL,37度,300 rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

    2)将上一步中的8 mL加入300 mL培养基中37度,250 rpm摇至OD= 1.0左右(约 2.5 h ~ 3 h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。)

    3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140 rpm左右。

    4)将菌液6000 rpm,4 min,4度 离心收集菌体。加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250 mL菌液用30 mL到50 mL平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50 mL的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。

4、超声波裂解:用6 mm变幅杆,35%功率,3.5 s工作,7 s休息,50 min即可。

5、取得上清

     将破碎好的溶液收集到50 mL离心管中。10000 rpm,15 min,4°C离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。(此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。)

6、纯化上清---摸洗脱条件。

     1)镍柱处理。将1 mL镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3 mL。

     2)将10 mL上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。(若是流速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1 mL的枪将胶体吹散。)取20 μL过柱后的样品,以备跑胶。

     3) 分别加20 mM、40 mM、60 mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4 mL、2 mL、2 mL、2 mL。每个次上样的液体分前面1 mL和后面1 mL分别收集入EP管中,以备跑胶。

     4)加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5 mL(将前面的0.5 mL单独接入EP 管,再将后面的4 mL接入另外两个EP管),留跑胶样品。

     5)加MES将NI柱重生。MES加10 mL,流完后再加10 mL Miliq H2O。流完后保存于2 倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。(尿素可能对NI柱有损伤。) 

7、跑胶验证。

     1)跑2块0.75 mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

     2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、 W7、W8、W9、E1、E2、MES  

     3)300 V快速压胶5 min左右,160 V分离样品50 min左右。(也可以300 V, 30 min,只是 图没有160 V好看。)

     4)考马斯亮蓝染色。一般染色2 h即可。

     5)脱色。先用脱色剂1脱15 min,再用脱色剂2脱过夜。

8、纯化上清---收集目的蛋白

     1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3 mL)。

     2)重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

9、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点(用160 V),保存好。

10、透析。

    1)配制2L透析液,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

    2)透析袋(剪10 cm即可)用透析袋处理液煮沸10 min,用MILIQ H2O充分洗净。

    3)用透析夹将透析袋夹住(将透析袋折叠一下会夹的更牢),将洗脱的蛋白样品加入其中,置入提前预冷的500 ml透析液(20 mM PBS+50 mM NaCl)中。冰浴下轻微磁力搅拌20 min

后置入4°C冰箱1.5 h后换液。透析3次即可。

11、浓缩。

    1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

    2)30 min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。

    3)每隔10 min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。

    4)透析袋用完后,洗净,保存于20%乙醇中4C°存放。

12、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。

    1)将4 mL Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

    2)配平。

    3)7400 g,30 min,4°C离心,结束时4 mL变为1 mL左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间,以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。

    4)加入需要的蛋白储存液至4 mL,离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可)助溶。

    5)收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白 浓度(测量后),制备日期。

13、蛋白浓度测定。

14、蛋白活性测试,转染细胞测量荧光。

15、抗原处理,蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

16、注射兔子,选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

17、收集免疫血清,提取抗体。

18、抗体效价评定。

服务说明

      1.客户提供:表达菌株或质粒。

      2.服务周期:3周。

      3.收费标准:欢迎来电咨询。

质量承诺

      1.纯度不低于85%的蛋白样品;

      2.原始实验数据;

      3.详细的实验步骤;

      4.权威的鉴定结果。